«Ферменти. Визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові».

 Інструкція до практичного заняття №8

Тема: «Ферменти. Визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові».

Обладнання: ФЕК, термостат, лабораторний посуд.

Реактиви та біологічний матеріал:  Субстратно – буферна суміш АсАТ та субстратно – буферна суміш АлАТ, 2,4 – динітрофенілгідрозин, 0,4 М розчин натрій гідроксиду, сироватка крові.

Основна:

·         Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009. — 352 с.

·         Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2007.— 320 с.

·         Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. — Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. — 736 с.

·         Губський Ю.І. Біологічна хімія. — К.: — Вінниця: Нова книга, 2007. — 656 с.

·         Іваницька Г.І., Люленко Л.В., Іваницька М.В. Практикум з клінічної біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. — 184 с.

·         Клінічна біохімія: підручник / Д.П. Бойків, Т.І. Бондарчук, О.В. Іванків та ін.; За ред О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2006. — 432 с.

·         Конспект лекцій

Додаткова:

·         Горячковский А.М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. — Одесса: Экология, 2005. — 607 с.

·         Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. — К.: Фітосоціоцентр, 2001. — 424 с.

·         Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия. — М.: БИНОМ, Невский Диалект, 2000. — 368с.

·         Практикум з біологічної хімії / За ред О.Я. Склярова. — К.: Здоров’я, 2002. — 298 с.

Мета: навчитися використовувати відомості про ферменти для діагностики захворювань,  ензимотерапії  та  розкриття  механізмів  виникнення ензимопатологій. Навчитися визначати активність АсАТ і АлАТ в сироватці крові.

Конкретні цілі:

 

Студент повинен:

Знати

Вміти

1.Загальну характеристику ферментів, біологічне значення. 2.Активний і алостеричний центр ферментів. 3.Поняття апоферменту, коферменту, простетичної групи, холоферменту. 4.Класифікацію коферментів. Коферментна функція вітамінів. 5.Кінетику ферментативних реакцій. Константа Міхаеліса. Залежність швидкості ферментативних реакцій від температури, рН, концентрації ферменту і субстрату, активаторів та інгібіторів. 6.Клініко-діагностичне значення визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові.

1.Готувати реактиви. 2.Проводити первинний відбір результатів досліджень за критерієм: норма/патологія. 3.Користуватися лабораторним устаткуванням: мірним посудом, піпетками, дозаторами. 4.Користуватися ФЕКом. 5.Визначати активність АсАТ і АлАТ в сироватці крові.. 6.Забезпечувати санітарно-протиепідемічний режим у лабораторії біологічної хімії з біохімічними методами дослідження.

 

Перелік практичних навичок:

1.Організація робочого місця.

2.Підготовка біологічного матеріалу для дослідження.

3. Визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові.

4.Знезараження відпрацьованого матеріалу.

Основні правила техніки безпеки і охорони праці:

1.Правила техніки безпеки при роботі з електроприладами (Додаток №1)

2.Правила роботи з інфікованим матеріалом (Додаток №2)

3.Дезінфекційні заходи (Додаток №3)

Хід роботи:

І.Теоретична конкретизація знань

Фронтальне опитування з елементами бесіди.

1.      Що таке ферменти?

2.      Яка хімічна природа ферментів?

3.      Дайте визначення поняттям „енергія активації”, „енергетичний бар’єр реакції”.

4.      Які відмінності мають ферменти від неорганічних каталізаторів?

5.      Які основні властивості мають ферменти у порівнянні з білками?

6.      Які властивості характерні тільки для ферментів?

7.      Які речовини виконують коферментну функцію у складі ферментів?

8.      Порівняйте каталітичну активність проферменту і ферменту.

9.      Які фактори впливають на швидкість ферментативної реакції?

10.  Дайте визначення поняттям „оптимум температури”,  „оптимум рН”, „активатори”, „інгібітори ферментів”.

11.  Як використовуються ферменти в медицині для діагностики захворювань?

12.  Які захворювання відносяться до ензимопатій? Наведіть приклади.

ІІ. Практична робота студента під керівництвом викладача

Визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові.

Принцип методу: Амінотрансферази – ферменти,  які каталізують процес переносу аміногрупи з амінокислот на кетокислоти. В основу набору реактивів покладений уніфікований метод визначення активності амінотрансферази в сироватці крові по Рейтману і Френкелю. В результаті переамінування, яке відбувається під дією АсАТ утворюється щавелевооцетова кислота і піровіноградна кислота. Щавелевооцетова кислота перетворюється в процесі реакції в піровіноградну кислоту. При додаванні 2,4 – дифенітрофенілгідрозину в лужному середовищі утворюється забарвлений гідразон піровіноградної кислоти інтенсивність забарвлення якого визначається колориметрично.

Проведення аналізу:

Дослідна проба: В пробірку містять 0,25 субстратно-буферного розчину для визначення АсАТ (АлАТ), нагрівають при 37⁰С на протязі 3 хв., додають 0,05 мл сироватки і інкубують при 37⁰С 60 хв. Додають 0,25 мл розчину 2,4-динітрофенілгідрозину і витримують протягом 20 хв. при кімнатній температурі. Додають 0,25 мл 0,4М розчину натрій гідроксиду, перемішують та залишають для розвитку забарвлення на 10 хвилин при кімнатній температурі. Вимірюють оптичну густину на ФЕКі при довжині хвилі 500-560 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм против контролю.

Контрольна проба: Обробляють як дослідну, але замість сироватки додають 0,05 мл фізіологічного розчину. Розрахунок активності ферментів в сироватці крові проводять по калібрувальному графіку.

 

Нормальні величини:

Активність АсАТ в сироватці крові -   0,1-0,45 ммоль/ (год*л)

Активність АлАТ в сироватці крові -  0,1-0,68 ммоль/ (год*л)

Примітка: Для визначення АсАТ і АлАТ беруть сироватку без ознак гемолізу; для визначення активності АлАТ і АсАТ беруть сироватку, яку можна зберігати за температури 4 ⁰С до 1 тиждня, за кімнатної температури – впродовж однієї доби; для приготування розчину натрій гідроксиду використовують дистильовану воду без карбонатів.

Клініко-діагностичне   значення   визначення   активності   АсАТ і АлАТ.

Визначення активності цих ферментів має важливе значення при захворюваннях печінки (особливо раннє виявлення гепатиту) та серця (враження серцевого м’язу, інфаркту міокарда).

Гострий гепатит супроводжується різким підвищенням АлАТ. АсАТ при цьому також підвищена, але нижче за АлАТ. Активність АлАТ вже починає збільшуватися вже в предромальній стадії, коли інші признаки хвороби ще не проявилися. Коефіцієнт Де Ритса АсАТ/АлАТ <1. При тяжкому ураженні печінки співвідношення активності ферментів змінюється.

Підвищення АлАТ спостерігається і в безжовтушних формах хвороби Боткіна. Метастази раку печінки також характеризується гіперамінотрансфераземіями. Механічні жовтухи не супроводжуються підвищенням активності амінотрансфераз.

При інфаркті міокарду активність АсАТ в сироватці крові підвищена, вона підвищується через 4-6 годин після інфаркту міокарду і знижується до норми на 3-7 день. 

 

Алгоритм виконання навички „Визначення активності АсАТ в сироватці крові”.

Біологічний матеріал:

Сироватка крові.

Реактиви:

·         2,4-динітрофенілгідразин розчин;

·         Субстратний розчин для АсАТ;

·         0,4М розчин натрій гідроксиду;

·         Фізіологічний розчин.

·         Дистильована вода;

·         Розчин антисептика;

·         Дез. розчин.

Обладнання:

·         ФЕК;

·         Набір кювет.

·         Термостат.

·         Лабораторний посуд:

·         Штатив з пробірками на 10 мл;

·         Піпетки місткістю 5,0,  0,1  та 1,0 мл.

     Допоміжний матеріал:

·         Марлеві серветки;

·         Олівець;

·         Калібрувальний графік.

·         Бланки аналізів.

І.Попередній етап:

Підготовка лаборанта. Медичному працівникові одягнути халат, шапочку.

Руки обробляємо за схемою:

1.Миємо руки двічі намилюючи мильним розчином.

2.Висушуємо руки паперовим рушником, яким закриваємо потім кран.

3.Наносимо на руки спиртовий антисептик і втираємо до висихання.

4.Нігтьові ложа обробляємо 5% розчином йоду.

5.Наносимо на руки спиртовий антисептик і витираємо до висихання.

6.Перевіряємо рукавички на цілісність. Одягаємо чисті рукавички.

Підготовка робочого місця.

1.Стіл обробляємо дез. розчином на 15 хвилин. Через 15 хвилин змиваємо стіл чистою водою.

2.На лоток поставити штатив з піпетками на 1мл (2 шт.) та  на 0,1 мл (2 шт.); 5,0 мл (1 шт.); штатив з пробірками на 10 мл; ємність з дистильованою водою для промивання піпеток; ємність з марлевими серветками; ємність для відходів; ємності №1 та №2  для промивання піпеток від біологічної рідини з дез. розчинами; спиртовий розчин антисептику; 2,4-динітрофеніллгідразину розчин; фізіологічний розчин; 0,4М розчин натрій гідроксиду; субстратний розчин АсАТ; сироватка крові; графік калібрувальний; бланк аналізів.

 ІІ. Основний етап.

1.В штатив приміщують 2 пробірки, позначених „Д” – дослідна проба, „К” –контрольна проба.

2. Відміряють по 0,25 мл субстратного розчину АсАТ і переносять відповідно в пробірки „Д” та „К”.

3.Пробірки інкубують при 37 ^оС 3 хвилини.

4.Відміряють 0,05 мл сироватки крові і переносять в пробірку „Д”.

5.Відміряють 0,05 мл фізіологічного розчину і переносять в пробірку „К”.

6.Вміст пробірок перемішують і інкубують при 37 ^оС 60 хвилин.

7.Відміряють по 0,25 мл розчину 2,4-динітрофенілгідрозину і переносять відповідно в пробірки „Д”, „К”.

8.Вміст пробірок перемішують і витримують 25 хвилин при кімнатній температурі.

9.Відміряють по 2,5 мл 0,4М розчину натрій гідроксиду і переносять відповідно в пробірки „Д”, „К”.

10.Вміст пробірок ретельно перемішують і залишають для розвитку забарвлення на 10 хвилин при кімнатній температурі.

11.Вимірюють оптичну щільність дослідної проби (Е досл) проти холостої проби. При довжині хвилі 500 – 560 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм.

12. Кювети промивають дистильованою водою і замочують в 6% розчині перекисі водню з миючим розчином на 1 год.

13.Розраховують активність АсАТ по калібрувальному графіку.

14. Записуємо результат в бланк аналізу.

ІІІ. Завершальний етап.

1. Вміст пробірок виливаємо в ємність і заливаємо дез. розчином з розрахунку 1 : 5.

2.Прополоскуємо пробірки в ємності №1 з дез. Розчином.

3.Замочуємо в ємності №2 з дез. розчином  на 1 год.

4. Видуваємо з піпетки біологічну рідину в ємність  з дез. розчином з розрахунку 1:5.

5.Прополоскуємо в ємності №1 для піпеток з дез. розчином.

6.Замочуємо в ємності №2 з дез. розчином. Груши також прополіскують спочатку в ємності №1 а потім замочують на 1 год. в ємності №2.

7.Знезаразити робоче місце. Протерти столик дез. розчином.

8.Знезаражуємо марлеві серветки (замочуємо в дез. розчині на 1 год. Промиваємо під проточною водою і викидаємо).

9.Зняти рукавички зовнішньою поверхнею всередину. Перевіряємо їх цілісність.  Замочити їх в розчині дезінфектанту на 60 хв.

10.Промити руки з милом під проточною водою, сполоснути і висушити їх паперовим рушником.

11.Обробити руки спиртовим антисептиком, втираючи його до висихання рук.

 

Алгоритм виконання навички „Визначення активності Аланін-Амінотрансферази в сироватці крові”.

Біологічний матеріал:

Сироватка крові.

Реактиви:

-          2,4-динітрофенілгідразин розчин;

-          Субстратний розчин для АлАТ;

-          0,4М розчин натрій гідроксиду;

-          Фізіологічний розчин.

-          Дистильована вода;

-          Розчин антисептика;

-          Дез. розчин.

Обладнання:

-          ФЕК;

-          Набір кювет.

-          Термостат.

     Лабораторний посуд:

-          Штатив з пробірками на 10 мл;

-          Піпетки місткістю 5,0,  0,1  та 1,0 мл.

     Допоміжний матеріал:

-   Марлеві серветки;

-   Олівець;

-   Калібрувальний графік.

-   Бланки аналізів.

І.Попередній етап:

Підготовка лаборанта. Медичному працівникові одягнути халат, шапочку.

Руки обробляємо за схемою:

1.Миємо руки двічі намилюючи мильним розчином.

2.Висушуємо руки паперовим рушником, яким закриваємо потім кран.

3.Наносимо на руки спиртовий антисептик і втираємо до висихання.

4.Нігтьові ложа обробляємо 5% розчином йоду.

5.Наносимо на руки спиртовий антисептик і витираємо до висихання.

6.Перевіряємо рукавички на цілісність. Одягаємо чисті рукавички.

Підготовка робочого місця.

1.Стіл обробляємо дез. розчином на 15 хвилин. Через 15 хвилин змиваємо стіл чистою водою.

2.На лоток поставити штатив з піпетками на 1мл (2 шт.) та  на 0,1 мл (2 шт.); 5,0 мл (1 шт.); штатив з пробірками на 10 мл; ємність з дистильованою водою для промивання піпеток; ємність з марлевими серветками; ємність для відходів; ємності №1 та №2  для промивання піпеток від біологічної рідини з дез. розчинами; спиртовий розчин антисептику; 2,4-динітрофеніллгідразину розчин; фізіологічний розчин; 0,4М розчин натрій гідроксиду; субстратний розчин АлАТ; сироватка крові; графік калібрувальний; бланк аналізів.

 ІІ. Основний етап.

1.В штатив приміщують 2 пробірки, позначених „Д” – дослідна проба, „К” –контрольна проба.

2. Відміряють по 0,25 мл субстратного розчину АлАТ і переносять відповідно в пробірки „Д” та „К”.

3.Пробірки інкубують при 37 ^оС 3 хвилини.

4.Відміряють 0,05 мл сироватки крові і переносять в пробірку „Д”.

5.Відміряють 0,05 мл фізіологічного розчину і переносять в пробірку „К”.

6.Вміст пробірок перемішують і інкубують при 37 ^оС 60 хвилин.

7.Відміряють по 0,25 мл розчину 2,4-динітрофенілгідрозину і переносять відповідно в пробірки „Д”, „К”.

8.Вміст пробірок перемішують і витримують 25 хвилин при кімнатній температурі.

9.Відміряють по 2,5 мл 0,4М розчину натрій гідроксиду і переносять відповідно в пробірки „Д”, „К”.

10.Вміст пробірок ретельно перемішують і залишають для розвитку забарвлення на 10 хвилин при кімнатній температурі.

11.Вимірюють оптичну щільність дослідної проби (Е досл) проти холостої проби. При довжині хвилі 500 – 560 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм.

12. Кювети промивають дистильованою водою і замочують в 6% розчині перекисі водню з миючим розчином на 1 год.

13.Розраховують активність АлАТ по калібрувальному графіку.

14. Записуємо результат в бланк аналізу.

ІІІ. Завершальний етап.

1. Вміст пробірок виливаємо в ємність і заливаємо дез. розчином з розрахунку 1 : 5.

2.Прополоскуємо пробірки в ємності №1 з дез. Розчином.

3.Замочуємо в ємності №2 з дез. розчином  на 1 год.

4. Видуваємо з піпетки біологічну рідину в ємність  з дез. розчином з розрахунку 1:5.

5.Прополоскуємо в ємності №1 для піпеток з дез. розчином.

6.Замочуємо в ємності №2 з дез. розчином. Груши також прополіскують спочатку в ємності №1 а потім замочують на 1 год. в ємності №2.

7.Знезаразити робоче місце. Протерти столик дез. розчином.

8.Знезаражуємо марлеві серветки (замочуємо в дез. розчині на 1 год. Промиваємо під проточною водою і викидаємо).

9.Зняти рукавички зовнішньою поверхнею всередину. Перевіряємо їх цілісність.  Замочити їх в розчині дезінфектанту на 60 хв.

10.Промити руки з милом під проточною водою, сполоснути і висушити їх паперовим рушником.

11.Обробити руки спиртовим антисептиком, втираючи його до висихання рук.

ІV. Контрольні питання до закріплення знань з теми «Обмін простих білків та амінокислот».

·         Ізоферменти та мультиферментні комплекси. Клінічне значення визначення ізоферментів у крові.

·         Механізм   дії   ферментів,   поняття   про   енергетику   та   кінетику ферментативних реакцій.

·         Види регуляції ферментативної активності.

·         Основні   напрямки   медичної   ензимології:   ензимопатологія, ензимодіагностика, ензимотерапія.

·         Ферменти,   інгібітори   ферментів,   коферменти,   вітаміни   як   лікарські препарати, їх клінічне застосування.

·         Принципи визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові.

 

V. Висновок до практичного заняття.

 

VІ. Домашнє завдання

Конспект лекції «Фенрменти»

Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009.(ст 149-175).

👀 Презентація з тестовим контролем знань по темі: "Обмін простих та складних білків"

👀 Тестовий контроль знань з теми: "Ферменти"