Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження: Обмін ліпідів. Визначення холестерину в сироватці крові.

Інструкція до практичного заняття №16

Тема: Обмін ліпідів. Визначення холестерину в сироватці крові.

Обладнання: лабораторний посуд, фотоелектроколориметр, бланки аналізів.

Реактиви: Реагент на холестерин, калібрувальний розчин холестерину, сірчана кислота, фізіологічний розчин натрій хлориду.

Біологічний матеріал: сироватка крові.

Основна:

· Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009. — 352 с.

· Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2007.— 320 с.

· Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. — Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. — 736 с.

· Губський Ю.І. Біологічна хімія. — К.: — Вінниця: Нова книга, 2007. — 656 с.

· Іваницька Г.І., Люленко Л.В., Іваницька М.В. Практикум з клінічної біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. — 184 с.

· Клінічна біохімія: підручник / Д.П. Бойків, Т.І. Бондарчук, О.В. Іванків та ін.; За ред О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2006. — 432 с.

· Конспект лекцій

Додаткова:

· Горячковский А.М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. — Одесса: Экология, 2005. — 607 с.

· Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. — К.: Фітосоціоцентр, 2001. — 424 с.

· Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия. — М.: БИНОМ, Невский Диалект, 2000. — 368 с.

· Практикум з біологічної хімії / За ред О.Я. Склярова. — К.: Здоров’я, 2002. — 298 с.

Мета: сформувати поняття про шляхи метаболізму холестерину у тваринному організмі, регуляцію його обміну, про роль холестерину в нормі і при патології; про механізми транспорту ліпідів та гормональну регуляцію ліпідного обміну.

Конкретні цілі:

Студент повинен:

Знати

Вміти

1.Холестерин: визначення, формула, біологічне значення.

2.Механізм реакцій синтезу холестерину.

3.Шляхи виведення холестерину з організму

4.Транспортні форми ліпідів: визначення, класифікація, характеристика окремих

класів ліпопротеїдів.

5.Нейрогуморальна регуляція ліпідного обміну

6.Патологія ліпідного обміну: атеросклероз, ожиріння, жовчно-кам’яна хвороба.

1.Готувати реактиви.

2.Проводити первинний відбір результатів досліджень за критерієм: норма/патологія.

3.Користуватися лабораторним устаткуванням: мірним посудом, піпетками, дозаторами.

4.Користуватися ФЕКом.

5.Визначати концентрацію холестерину в сироватці крові.

6.Забезпечувати санітарно-протиепідемічний режим у лабораторії біологічної хімії з біохімічними методами дослідження.

Перелік практичних навичок:

1.Організація робочого місця.

2.Підготовка біологічного матеріалу для дослідження.

3. Визначення концентрації холестерину в сироватці крові.

4.Знезараження відпрацьованого матеріалу.

Хід роботи:

І.Теоретична конкретизація знань

Фронтальне опитування з елементами бесіди:

1.Написати початкові реакції синтезу холестерину до стадії утворення мевалонової кислоти.

2. Характеризувати регуляцію синтезу холестерину.

3.Трактувати шляхи виведення холестерину з організму.

4.Довести фізіологічну роль холестерину в нормі і при патології.

5.Проаналізувати склад та значення транспортних форм ліпідів.

6.Оцінити нейрогуморальну регуляцію ліпідного обміну.

ІІ. Практична робота студента під керівництвом викладача

Визначення концентрації холестерину в сироватці крові.

Приготування робочих розчинів:

1.Робочий розчин: Вміст флакона з реактивом на холестерин перенести до термостійкої колби місткістю 200 мл та поступово додати, при охолодженні холодною водою і перемішуванні, 9 мл сірчаної кислоти з флакона. Отриманий реактив повинен бути безбарвним або блідо-жовтим. Зберігається на протязі одного тижня у холодильнику в склянці із темного скла з добре притертою скляною пробкою. Якщо реактив набуде жовтого кольору, то він не придатний до використання.

2.Калібрувальний розчин холестерину – придатний до використання. Після розкриття ампули реактив бережуть у холодильнику в посуді з добре притертою скляною або пластмасовою пробкою. При збереженні в герметичній ємкості розчин стійкий.

Принцип методу: при взаємодії сульфатної кислоти з холестерином утворюються забарвлені в червоно-фіолетовий колір продукти розпаду холестерину.

Проведення аналізу:

Відміряти у кювету, мл	Дослідна проба			Холоста проба			Калібрувальна проба
Відміряти у кювету, мл	Макро-аналіз	Напівмікро-аналіз	Мікро-аналіз	Макро-аналіз	Напівмікро-аналіз	Мікро-аналіз	Макро-аналіз	Напівмікро-аналіз	Мікро-аналіз
Робочий розчин	4,30	2,10	1,05	4,3	2,10	1,05	4,3	2,10	1,05
Аналізо-ваний розчин	0,1	0,1	0,05	-	-	-	-	-	-
Фізіологіч-ний розчин натрій хлориду	-	-	-	0,1	0,1	0,05	-	-	-
Калібру-вальний розчин холестери-ну	-	-	-	-	-	-	0,1	0,1	0,05
До робочого розчину повільно, по стінці пробірки, додають негемолізовану сироватку або калібрувальний розчин. Пробірку енергійно струшують 10-12 разів та витримують у термостаті при 37 ⁰С протягом 20 хв. Вимірюють оптичну щільність дослідної Е досл. та калібрувальної проби Е кал. проти холостої проби. Забарвлення стійке протягом 20 хв. Фотометрують при довжині хвилі 630-690 нм у кюветі завтовшки 10 або 5 мм.

Розрахунок:

Здійснюють згідно формули:

С = (Едосл / Екал)*4,665 ммоль/л, де

С-концентрація у дослідній пробі, ммоль/л;

Едосл – ектінція дослідної проби, од. опт. щільності;

Екал – екстінція калібрувальної проби, од. опт. щільності;

4,665 – концентрація холестерину у калібрувальному розчині, ммоль/л.

Нормальні величини вмісту холестерину: 3,0-6,29 ммоль/л або 116-242 мг %

Примітки:

Лабораторний посуд і фотометруючі кювети, які призначені для визначення холестерину, повинні бути ретельно висушені. Допускається використовувати тільки скляний посуд і кювети.

Для проведення аналізу можуть використовуватися і кювети товщиною 10 мм. У цьому випадку об’єм робочого розчину подвоюють, не змінюючи об’єм сироватки, взятої для аналізу.

Застережні заходи:

При роботі з набором слід використовувати загальні правила обережності при роботі з концентрованими кислотами.

При попаданні реагенту на холестерин або його робочого розчину на шкіру його слід негайно змити великою кількістю води, промити вражену зону 5%-ним розчином бікарбонату натрію. В процесі праці слід використовувати гумові рукавички.

Клініко-діагностичне значення.

Дослідження рівня холестерину в сироватці крові не дає точної діагностичної інформації о конкретному захворюванні, а лише відображають патологію обміну ліпідів в організмі.

Верхня межа рівня концентрації холестерину у віці 20-29 років складає 5,17 ммоль/л. Високий ризик розвитку коронарного атеросклерозу у середньому віці 30-39 і старше 40 років має місце при рівнях холестерину, який перевищує відповідно 6,21 і 6,72 ммоль/л. У чоловіків старше 60 років вміст холестерину в сироватці крові нижче, чим у чоловіків 50-60 років. Це пов’язано зі зменшенням продукції та секреції в кров статевих гормонів. Вміст холестерину в сироватці крові жінок дітородного віку нижче, чим у чоловіків; після 60 років відмінності в рівні холестерину зникають.

Гіперхолестеринемія:

· атеросклероз;

· інфаркт міокарда;

· цукровий діабет;

· злоякісних пухлинах підшлункової залози та простати;

· подагрі;

· авітамінозі В;

· ожирінні;

· хронічному алкоголізмі;

· ліпоїдном нефрозі.

Гіпохолестеринемія:

· гострі інфікціонні захворювання;

· бронхіт;

· анемія;

· гострий гепатит;

· ревматизм;

· злоякісних пухлинах печінки;

· лихоманках;

· подразненні центральної ниркової недостатності.

ІV. Контрольні питання до закріплення знань з теми «Обмін ліпідів. Визначення холестерину в сироватці крові»:

- Біосинтез холестерину в організмі людини:

· локалізація цього процесу, значення;

· етапи синтезу холестерину;

· регуляція синтезу холестерину.

- Шляхи біотрансформації холестерину (етерифікація, утворення жовчних кислот та стероїдних гормонів, синтез вітаміну D₃, екскреція з організму).

-Патології ліпідного обміну:

• атеросклероз: механізми розвитку, роль генетичних факторів, гіперхолестеринемії;

• порушення ліпідного обміну при цукровому діабеті;

• патологічні процеси обміну ліпідів, які ведуть до розвитку ожиріння.

V. Висновок до практичного заняття.

VІ. Домашнє завдання.

• Конспект лекції «Обмін ліпідів»

• Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009.(ст. 247-274).

• Практикум з клінічної біохімії: навч. Посібник /Г.І. Іваницька, Л.В.Люленко, М.В. Іваницька; за редакцією Г.І. Іваницької. – К.: ВСВ «Медицина», 2010. (ст.113-116)