Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження: Обмін ліпідів. Визначення тригліцеридів в сироватці крові.

Інструкція до практичного заняття №15

Тема: Обмін ліпідів. Визначення тригліцеридів в сироватці крові.

Обладнання: лабораторний посуд, фотоелектроколориметр, термостат, центрифуга, бланки аналізів.

Реактиви: розчин ацетілацетону, розчин окислювача, калібрувальний розчин, ізопропіловий спирт, адсорбент, гідроокис натрію.

Біологічний матеріал:сироватка крові.

Основна:

- Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009. — 352 с.

- Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2007.— 320 с.

- Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. — Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. — 736 с.

- Губський Ю.І. Біологічна хімія. — К.: — Вінниця: Нова книга, 2007. — 656 с.

- Іваницька Г.І., Люленко Л.В., Іваницька М.В. Практикум з клінічної біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. — 184 с.

- Клінічна біохімія: підручник / Д.П. Бойків, Т.І. Бондарчук, О.В. Іванків та ін.; За ред О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2006. — 432 с.

- Конспект лекцій

Додаткова:

- Горячковский А.М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. — Одесса: Экология, 2005. — 607 с.

- Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. — К.: Фітосоціоцентр, 2001. — 424 с.

- Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия. — М.: БИНОМ, Невский Диалект, 2000. — 368 с.

- Практикум з біологічної хімії / За ред О.Я. Склярова. — К.: Здоров’я, 2002. — 298 с.

Мета: сформувати поняття про шляхи метаболізму тригліцеридів в організмі людини, регуляцію його обміну, про механізми транспорту ліпідів та гормональну регуляцію ліпідного обміну.

Конкретні цілі:

Студент повинен:

Знати

Вміти

1.Тригліцериди: визначення, формула, біологічне значення.

2.Катаболізм триацилгліцеридів: механізм, ферменти, гормональна регуляція лі полізу.

3.β-окислення жирних кислот: послідовність реакцій, ферменти, коферменти, енергетичний баланс.

4. Особливості окислення ненасичених жирних кислот і гліцерину

5. Синтез триацилгліцеридів: джерела, механізм. Фосфатидна кислота

6. Ацетонові (кетонові) тіла: визначення, біосинтез (кетогенез), розпад (кетоліз), біологічне значення.

7.КДЗ визначення концентрації тригліцеридів сироватці крові.

1.Готувати реактиви.

2.Проводити первинний відбір результатів досліджень за критерієм: норма/патологія.

3.Користуватися лабораторним устаткуванням: мірним посудом, піпетками, дозаторами.

4.Користуватися ФЕКом.

5.Визначати концентрацію тригліцеридів в сироватці крові.

6.Забезпечувати санітарно-протиепідемічний режим у лабораторії біологічної хімії з біохімічними методами дослідження.

Перелік практичних навичок:

1.Організація робочого місця.

2.Підготовка біологічного матеріалу для дослідження.

3. Визначення концентрації холестерину в сироватці крові.

4.Знезараження відпрацьованого матеріалу.

Основні правила техніки безпеки і охорони праці:

1.Правила техніки безпеки при роботі з електроприладами (Додаток №1)

2.Правила роботи з інфікованим матеріалом (Додаток №2)

3.Дезінфекційні заходи (Додаток №3)

Хід роботи:

І.Теоретична конкретизація знань

Фронтальне опитування з елементами бесіди:

• Біологічні функції простих і складних ліпідів в організмі людини (запасна, енергетична, участь в терморегуляції, біосинтетична).

• Участь ліпідів у побудові та функціонуванні біологічних мембран клітин

• Катаболізм триацилгліцеролів: характеристика внутрішньоклітинного ліполізу, його біологічне значення.

• Ферментативні реакції; механізми регуляції активності триацилгліцеролліпази.

• Нейрогуморальна регуляція ліполізу за участю адреналіну, норадреналіну, глюкагону, інсуліну; енергетика окиснення триацилгліцеролів.

• Біосинтез триацилгліцеролів та фосфоліпідів, значення фосфатидної кислоти.

• β-окиснення вищих жирних кислот.

• Метаболізм кетонових тіл.

ІІ. Практична робота студента під керівництвом викладача

Визначення концентрації тригліцеридів в сироватці крові.

Принцип методу: Триацилгліцериди екстрагують із сироватки крові. Під час лужного гідролізу виділяється гліцерин, який окислюється о формальдегіду за участю натрію метаперйодату. Формальдегід, що утворюється, з ацетил ацетоном у слабо ацетатному розчині перетворюється на 3,5-діацетил-1,4-игідролютидин, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту триацилгліцеридів.

Проведення аналізу:

Відміряти у пробірку	Дослідна проба	Калібрувальна проба	Контрольний розчин
Сироватка крові	0,1	-	-
Дистильована вода	-	-	0,1
Калібрувальний розчин	-	0,1	-
Ізопропіловий спирт	4,00	4,00	4,00
До всіх пробірок додають 0,4 г адсорбенту, перемішують, вміст пробірок струшують протягом (5-10) хв і центрифугують 5 хв при 3000 об/хв. Потім у сухі пробірки відмірюють
Над осадова рідина	2,00	2,00	2,00
Гідроокис натрію	0,5	0,5	0,5
Вміст перемішують пробірки закривають кришкою і інкубують (5-10) хв при температурі плюс 60 ⁰С. Охолоджують 5 хвилин у холодній воді у всі пробірки відмірюють
Розчин окислювача	0,5	0,5	0,5
Витримують 10 хвилин при кімнатній температурі
Розчин ацетилацетону	0,5	0,5	0,5
Вміст перемішують і інкубують точно 30 хв. При температурі плюс 60 ⁰С. Після охолодження вимірюють оптичну щільність дослідженої (Е1) і калібрувальної (Е2) проти контрольного розчину. Фотометрують при довжині хвилі (405-420) нм при довжині оптичного шляху 10мм.

Розрахунок здійснюють за формулою:

С – (Е₁/Е₂) * 3,0, де:

С – концентрація тригліцеридів у пробі, ммоль/л;

Е₁ – екстинція дослідної проби, од. опт. щільності;

Е₂ – екстинція калібрувальної проби, од. опт. щільності;

3,0 – концентрація тригліцеридів у калібрувальному розчині, ммоль/л.

Норма: тригліцериди (0,45 – 1,86) ммоль/л.

Примітка: посуд, що використовують при визначенні тригліцеринів повинний бути очищений від жирових забруднень і залишків синтетичних миючих засобів.

Дослідження необхідно проводити у хворого після 12-14-годинного голодування.

Клініко-діагностичне значення.

Гіпотригліцеридемія. Рівень тригліцеринів плазми знижується при:

• гіпопротеїнемії,

• лактозурії;

• хронічних обструктивних захворювань легень;

• гіпертиреозі

• подразненні паренхіми печінки.

Гіпертригліцеридемія: Збільшення концентрації нейтральних жирів в крові (більше за 2,3 ммоль/л) відображає підвищення ЛПДНЩ та ХМ. Для встановлення вмісту ЛПДНЩ знаходять розрахунковим методом концентрацію ХС-ЛПДНЩ (пре-бета ХС), або ХС-пре-бета-ЛП. З цією метою показник концентрації тригліцеринів (який не перевищує 3,4 ммоль/л) ділять на 2,2, оскільки молекулярний вміст тригліцеридів в ліпідній фазі частинок ЛПДНЩ в 2,2 рази перевищує кількість холестеролу. Цим пояснюється, чому найбільш високе значення вмісту в крові тригліцеридів знаходять при гіперліпопротеїнемії І типу (Гіперхіломікронемії), ІV типу (Гіперпребеталіпопротеїнемії), Типу (Гіпербеталіпопротеїнемії з гіперхіломікронемієй).

Гіпертригліцеридемія спостерігається у хворих на:

• ожиріння;

• вірусний гепатит;

• алкогольний цироз печінки;

• подагру;

• хронічну ниркову недостатність;

• гіпертонічну хворобу;

• цукровий діабет.

ІV. Контрольні питання до закріплення знань з теми «Обмін ліпідів. Визначення тригліцеридів в сироватці крові».

1.Принцип методу визначення тригліцеридів в сироватці крові.

2.Норма та КДЗ визначення концентрації тригліцеридів в сироватці крові.

3.Охарактеризуйте метаболічні джерела синтезу нейтральних жирів.

4.Яку функцію виконують міцели в процесі всмоктування ліпідів і як вони утворюються?

5.Яка функція хіломікронів в надходженні жиророзчинних компонентів в кров?

6.Як проходить обмін тригліцеридів в клітинах?

7.Як проходить обмін жирних кислот в організмі?

8.Чим пояснюється велика енергетична цінність жирних кислот?

V. Висновок до практичного заняття.

VІ. Домашнє завдання:

- Конспект лекції «Обмін ліпідів»

- Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009.(ст. 247-274).

- Практикум з клінічної біохімії: навч. Посібник /Г.І. Іваницька, Л.В.Люленко, М.В. Іваницька; за редакцією Г.І. Іваницької. – К.: ВСВ «Медицина», 2010. (ст.-106-109)