Вітаємо Вас на нашому блозі! ТУТ Ви можете ознайомитися з матеріалами теоретичних і практичних занять. З повагою, викладачі біохімії Бабій О.В. та Дубінська О.А.

Ферменти. Визначення активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові

            Інструкція до практичного заняття 

Тема: «Ферменти. Визначення  активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові».

Спеціальність 5.12010201 «Лабораторна діагностика»

Обладнання: ФЕК, термостат, лабораторний посуд.

Реактиви та біологічний матеріал: гліцерофосфатний буфер, розчин натрій гідроксиду — 0,1 моль/л, розчин оцтової кислоти — 1 моль/л, розчин ТХО —100 г/л, розчин амоній молібдату — 25 г/л, розчин сульфітної кислоти — 2,5 моль/л, суміш амоній молібдату, розчин тіосечовини — 90 г/л, розчин сульфітної кислоти — 0,05 моль/л, калібрувальні розчини фосфору, сироватка крові.

Основна:

ü  Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009. — 352 с.

ü  Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2007.— 320 с.

ü  Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. — Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. — 736 с.

Губський Ю.І. Біологічна хімія. — К.: — Вінниця: Нова книга, 2007. — 656 с.

ü  Іваницька Г.І., Люленко Л.В., Іваницька М.В. Практикум з клінічної біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. — 184 с.

ü  Клінічна біохімія: підручник / Д.П. Бойків, Т.І. Бондарчук, О.В. Іванків та ін.; За ред О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2006. — 432 с.

ü  Конспект лекцій

Додаткова:

Горячковский А.М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. — Одесса: Экология, 2005. — 607 с.

Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. — К.: Фітосоціоцентр, 2001. — 424 с.

Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия. — М.: БИНОМ, Невский Диалект, 2000. — 368 с.

Практикум з біологічної хімії / За ред О.Я. Склярова. — К.: Здоров’я, 2002. — 298 с.

Мета: навчитися використовувати відомості про ферменти для діагностики захворювань,  ензимотерапії  та  розкриття  механізмів  виникнення ензимопатологій. Навчитися визначати активність основної та кислої фосфатази в сироватці крові в сироватці крові.

Конкретні цілі:

 

Студент повинен:

Знати

Вміти

1.Ферменти: визначення; властивості ферментів як біологічних каталізаторів.

2. Класифікація та номенклатура ферментів.

3. Будова та хімічна природа ферментів.

4. Кофактори. Коферменти. Ізоферменти, особливості будови та функціонування, значення в діагностиці захворювань.

5. Механізми дії та кінетика ферментативних реакцій.

6. Активатори та інгібітори ферментів. Типи інгібірування ферментів.

7. Принципи та методи виявлення ферментів у біооб'єктах. Одиниці виміру

активності та кількості ферментів.

8. КДЗ  визначення активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові.

1.Готувати реактиви.

2.Проводити первинний відбір результатів досліджень за критерієм: норма/патологія.

3.Користуватися лабораторним устаткуванням: мірним посудом, піпетками, дозаторами.

4.Користуватися ФЕКом.

5.Визначати активність основної та кислої фосфатази в сироватці крові

6.Забезпечувати санітарно-протиепідемічний режим у лабораторії біологічної хімії з біохімічними методами дослідження.

 Перелік практичних навичок:

1.Організація робочого місця.

2.Підготовка біологічного матеріалу для дослідження.

3. Визначення активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові в сироватці крові.

4.Знезараження відпрацьованого матеріалу.


Хід роботи:

І.Теоретична конкретизація знань

Фронтальне опитування з елементами бесіди.

1.Поняття про ферменти, їх значення в процесах життєдіяльності, історія ферментології.

2.Номенклатура та класифікація ферментів.

3.Поняття про активний та алостеричний центри ферментів. Алостеричний ефект. Регуляторні ферменти.

4.Властивості ферментів як біокаталізаторів: специфічність дії, термолабільність, залежність ферментативної активності від рН середовища.

5.Активатори та інгібітори ферментів. Типи гальмування ферментативних реакцій. Застосування інгібіторів ферментів як лікарських препаратів в медичній практиці.

6.Принципи визначення та одиниці ферментативної активності.

7.Хімічна природа та структура ферментів.

8.Поняття про коферменти, їх значення, класифікація коферментів.

9.Вітаміни-попередники коферментів, їх класифікація. Загальні поняття вітамінології (вітаміни, антивітаміни, провітаміни, гіпо-, гіпер- та авітамінози, вітаміноподібні речовини).

10.Коферменти І-ї групи (переносники електронів та протонів), їх представники. Характеристика вітамінів РР, В2, С як попередників вітамінних коферментів цієї групи.

11.Коферменти ІІ-ї групи (переносники окремих хімічних груп), їх представники. Характеристика вітамінів В1, В3, В6, В8, В9, та В12 як попередників коферментів ІІ групи.

12.Жиророзчинні вітаміни, їх участь в обміні речовин.

13.Ізоферменти та мультиферментні комплекси. Клінічне значення визначення ізоферментів у крові.

14.Механізм дії ферментів, поняття про енергетику та кінетику ферментативних реакцій.

15.Види регуляції ферментативної активності.

16.Основні напрямки медичної ензимології: ензимопатологія, ензимодіагностика, ензимотерапія.

 ІІ. Практична робота студента під керівництвом викладача

Визначення активності лужної і кислої фосфатаз у сироватці крові

Принцип методу: Під впливом лужної і кислої фосфатаз сироватки крові суб­страт β-гліцерофосфат гідролізується з вивільненням неорганіч­ного фосфору, кількість якого визначають фотометрично.

Реактиви:

·         гліцерофосфатний буфер:

а) основний: 10 г натрій (3-гліцерофосфату; 8,5 г барбіталу розчиняють і доводять об'єм до 1 л дистильованою водою. Збері­гають за температури 4 °С;

б) лужний робочий (для визначення активності лужної фос­фатази): рН основного буфера (500мл) доводять до 9,4 розчином натрій гідроксиду (0,1 моль/л), доводять об'єм до 1 л дистильова­ною водою. Зберігають за температури 4 °С до 10 діб;

в) кислий робочий (для визначення активності кислої фосфа­тази): рН основного буфера (500 мл) доводять до 4,5—4,9 розчи­ном оцтової кислоти (1 моль/л), об'єм доводять до 1 л дистильо­ваною водою. Зберігають за температури 4 °С до 10 діб;

·         розчин натрій гідроксиду — 0,1 моль/л;

·         розчин оцтової кислоти — 1 моль/л;

·         розчин ТХО —100 г/л;

·         розчин амоній молібдату — 25 г/л. Розчин нестійкий;

·         розчин сульфітної кислоти — 2,5 моль/л: 68 мл концентро­ваної сульфітної кислоти розчиняють у дистильованій воді, об'єм доводять до 500 мл;

·         суміш амоній молібдату: амонію молібдат і сульфітну кис­лоту змішують в однакових співвідношеннях;

·         розчин тіосечовини — 90 г/л;

·         розчин сульфітної кислоти — 0,05 моль/л;

·         калібрувальні розчини фосфору:

а) основний — 5 ммоль/л: 680 мг калій дигідрогенфосфату розчиняють у дистильованій воді, добавляють 20 мл розчину сульфітної кислоти (0,05 моль/л), змішують, доводять об'єм до 1 л дистильованою водою. Розчин придатний упродовж невизначеного терміну; б) робочий калібрувальний розчин — 0,5 ммоль/л. Готують безпосередньо перед роботою.

Таблиця 1.

Визначення активності фосфатаз у сироватці крові

Хімічний посуд

Місткість піпетки,

мл

Реактив

Проба,

мл

Калібру­вальна,

мл

Холос­та, мл

Етап

Центри­фугальні пробірки

5

Робочий бу­фер (37 °С)

5

5

5

Фермен­тативна реакція

 

 

1

Сироватка крові

0,5

—

—

 

 

 

 

1

Калібруваль­ний розчин

—

0,5

—

 

 

 

 

1

Дистильована вода

—

—

0,5

 

 

 

 

Змішують, інкубують упродовж 60 хв за температу­ри 37°С

 

 

 

 

5

Розчин ТХО

0,5

4,5

4

Оса­дження білків

 

 

Змішують, інкубують упродовж 10 хв за кімнатної

температури; центрифугують упродовж 10 хв за

швидкості 1500 об/хв (або відфільтровують)

 

 

Хімічні пробірки

5

Центрифугат (або фільтрат)

5

5

5

 

 

1

Дистильована вода

0,5

0,5

0,5

 

 

 

5

Суміш амонію молібдату

2,5

2,5

2,5

 

 

 

 

2

Суміш тіосе­човини

2

2

2

Колірна реакція

Розчини змішують, інкубують упродовж 30 хв. за кімнатної температури. Колориметрують калібрувальний розчин за довжи­ни хвилі 630—690 нм у кюветі завтовшки 10 мм проти холостої проби.



Розраховують Еп - Ек за калібрувальним графіком (табл. 2).

Перераховують активність ферменту в мілімолях неорганіч­ного фосфору, що утворюється внаслідок інкубації 1 л сироватки крові впродовж 1 год за температури 37 °С, розраховують за фор­мулою:

Аф = (а·1,47·104) / 31,

де  Аф —  кількість міліграмів неорганічного фосфору, який знахо­дять за калібрувальним графіком; 1,47-104 — коефіцієнт перера­хунку з 0,068 ммоль на 1 л сироватки; 31 — маса 1ммоль неорганічного фосфору, мг.

 Дані для побудови калібрувального графіка для визначення активності фосфатаз

 

Робочий розчин фосфо­ру, мл

Концен­трація фосфо­ру, мг

Концентрація

фосфору в 1,5 мл розчину

100

г/л ТХО,

мл

Вода дисти­льована, мл

Об'єм ві­дібраної суміші,

мл3

Розчин моліб­дату, мл

90 г/л тіосе­чови­ни

0,6

0,006

0,001

2,5

5,9

1,5

1

1

1,2

0,012

0,002

2,5

5,3

1,5

1

1

2,4

0,024

0,004

2,5

4,1

1,5

1

1

3,6

0,036

0,006

2,5

2,9

1,5

1

1

4,8

0,048

0,008

2,5

1,7

1,5

1

1

6

0,060

0,010

2 5

0 5

15

1

1

Через 10 хв колориметрують за червоного світлофільтра у кюветі завтовшки 5мм проти дистильованої води.

Графік будують на міліметровому папері. На осі абсцис від­кладають значення концентрації фосфору в 1,5 мл розчину, на осі ординат — відповідні значення екстинкцій. За одиницю масшта­бу на осі абсцис бажано брати позначку менше ніж 20 мм; у та­кому разі графік отримують великий, а можливість припуститися помилки під час побудови графіка зменшується.

Норма активності лужної фосфатази—0,5—1,3 ммоль/(год•л); активності кислої фосфатази —- 0,025—0,12 ммоль /(год•л).

Примітка. Для визначення активності лужної фосфатази беруть сироватку крові натще, її можна зберігати за температури 4 °С до 5 діб, а для визначення активності кислої фосфатази — свіжу сироватку.

Клініко-діагностичне значення. Підвищення активнос­ті лужної фосфатази виявляють при захворюваннях кісток, пов'язаних із проліферацією остеобластів, та при хворобах, пов'язаних із холестазом. Активність лужної фосфатази підви­щується при рахіті ще до появи клінічних симптомів, що сприяє виявленню його латентних (прихованих) форм. Активність фер­менту спостерігають при гіперпаратиреозі, карциномі кісткової тканини, саркомі кісток, остеомі, хондромі, мієломі, метастазу­ванні пухлин у кістки та печінку. Різке підвищення — при жовтій атрофії, обтураційній жовтяниці, міопатії.

Зниження активності лужної фосфатази характерне для гіпо­тиреозу, гіповітамінозу С, старечого остеопорозу, анемії Кулі, ензимопатії, зумовленої природженим дефіцитом вмісту ферменту в остеобластах кісток.

Кислу фосфатазу визначають для діагностування новоутво­рень передміхурової залози. Активність кислої фосфатази осо­бливо підвищується в разі метастазування пухлини передміхуро­вої залози.

ІV. Контрольні питання до закріплення знань з теми «Обмін простих білків та амінокислот».

Принципи визначення активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові.

Нормальні величини активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові.

КДЗ визначення активності основної та кислої фосфатази в сироватці крові.

V. Висновок до практичного заняття.

 VІ. Домашнє завдання

  • Конспект лекції «Обмін вуглеводів»

  • Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. — К.: Медицина, 2009.(ст. 196-231).

  • Іваницька Г.І., Люленко Л.В., Іваницька М.В. Практикум з клінічної біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. (ст. 92-97)



Немає коментарів:

Нові коментарі наразі не дозволено.

Підписатися на: Дописи (Atom)