Інструкція до практичного заняття
Тема: «Ферменти. Визначення активності
креатинфосфокінази (КФК) в сироватці крові».
Спеціальність
5.12010201 «Лабораторна діагностика»
Обладнання: ФЕК,
термостат, лабораторний посуд.
Реактиви
та біологічний матеріал:
- Реагент 1. Імідазол рН
6.7 - 125 ммоль/л; D-глюкоза - 25
ммоль/л; N-ацетил-L-цистеин (NАС) - 25 ммоль/л; ацетат магнезіі – 1.25 ммоль/л;
НАДФ – 2.52 ммоль/л; ЕДТА – 2.02 ммоль/л; гексокіназа ≥ 6 800 Од/л.
- Реагент 2. АДФ – 15.2 ммоль/л; АМФ -
25 ммоль/л; діаденозин-5-пентафосфат -
103 ммоль/л, Г6Ф-ДГ ≥8 800 Од/л; креатинфосфат - 250 ммоль/л.
- сироватка крові.
Основна:
ü
Біологічна хімія з біохімічними методами
дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило.
— К.: Медицина, 2009. — 352 с.
ü Біохімічні показники в нормі і при
патології / За ред. О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2007.— 320 с.
ü Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. — Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. —
736 с.
Губський Ю.І. Біологічна хімія. — К.: —
Вінниця: Нова книга, 2007. — 656 с.
ü Іваницька Г.І., Люленко Л.В., Іваницька М.В. Практикум з клінічної
біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. — 184 с.
ü Клінічна
біохімія: підручник / Д.П. Бойків, Т.І. Бондарчук, О.В. Іванків та
ін.; За ред О.Я. Склярова. — К.: Медицина, 2006. — 432 с.
ü Конспект лекцій
Додаткова:
- Горячковский
А.М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. —
Одесса: Экология, 2005. — 607 с.
- Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д.,
Войціцький В.М.
Сучасні методи біохімічних досліджень. — К.: Фітосоціоцентр, 2001. — 424 с.
- Маршалл
В. Дж. Клиническая биохимия. — М.: БИНОМ, Невский
Диалект, 2000. — 368 с.
- Практикум з
біологічної хімії / За ред О.Я. Склярова. — К.: Здоров’я, 2002. — 298 с.
Мета:
навчитися
використовувати відомості про ферменти для діагностики захворювань, ензимотерапії
та розкриття механізмів
виникнення ензимопатологій. Навчитися визначати активність КФК в
сироватці крові.
Конкретні
цілі:
Студент повинен:
|
Знати |
Вміти |
|
1.Визначення термінів «фермент»,
«кофермент», «апофермент». 2.Одиниці виміру активності
ферментів. 3.Основні властивості ферментів. 4.Класифікацію ферментів. 5.Механізм дії ферментів. 6.Види інгібірування. 7.Клініко-діагностичне значення
визнаяення КФК у біологічних рідинах. |
1.Готувати реактиви. 2.Проводити первинний відбір результатів досліджень за критерієм:
норма/патологія. 3.Користуватися лабораторним устаткуванням: мірним посудом, піпетками,
дозаторами. 4.Користуватися ФЕКом. 5.Визначати активність КФК в біологічних рідинах. 6.Забезпечувати санітарно-протиепідемічний режим у лабораторії
біологічної хімії з біохімічними методами дослідження. |
1.Організація
робочого місця.
2.Підготовка
біологічного матеріалу для дослідження.
3. Визначення активності КФК в сироватці крові.
4.Знезараження
відпрацьованого матеріалу.
Хід роботи:
І.Теоретична
конкретизація знань
Фронтальне опитування з елементами бесіди.
1. Охарактеризуйте хімічну природу та будову
ферментів.
2.Назвіть особливості ферментативного каталізу.
3.Одиниці активності ферментів.
4.Опишіть механізм дії та особливості ферментативного
каталізу.
5.Наведіть загальну
характеристику ензипопатій.
6.Яке значення має визначення ферментів у біологічних
рідинах?
Визначення КФК в сироватці
крові.
Принцип методу: Креатинфосфокіназа
(КФK) каталізує перенесення фосфатної групи від креатинфосфата до АДФ. Ця
реакція пов'язана з такими каталізаторами як гексокіназа (ГК) і
глюкозо-6-фосфат дегідрогеназа (Г6Ф-ДГ):
КФК
Креатинфосфат + АДФ ________> Креатин + АТФ
ГК
АТФ + D-Глюкоза _______> АДФ + Г6Ф
Г6Ф-ДГ
Г6Ф + НАДФ+ __________> 6-Фосфоглюконат + НАДФ + H+
Швидкість утворення НАДФ пропорційна каталітичний активності КФK, що міститься
у зразку і вимірюється на фотометрі.
Підготовка
реагентів:
Перед
використанням набір витримати при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.
Приготування
робочого реагенту РР: змішайте 4
об’єми Р1 + 1 об'єм Р2.
РР стабільний 2 тижня при 2-8ºC або
48 годин при кімнатній температурі
15-25ºC.
Проведення
аналізу:
1.
Умови вимірювання:
довжина хвилі 340 нм
кювета з товщиною оптичного шару 1 см
температура 25ºС / 30ºС
/ 37ºС
2. Налаштувати прибор на нуль відносно дистильованої води.
3. Наповнення кювети: компоненти реакційної суміші відібрати та вносити в
об'ємах, вказаних в таблиці.
|
|
25-30ºC |
37ºC |
|
РР, мл |
1.0 |
1.0 |
|
Зразок, мл |
0,04 |
0,02 |
4.
Перемішати, інкубувати протягом 2 хвилин.
5.
Виміряти первинну оптичну щільність(Е) дослідного зразка, включити секундомір і
виміряти Е з інтервалом в 1 хвилину
протягом 3-х хвилин.
6. Підрахуйте різницю між Е і середнє значення
зміни Е за хвилину (ΔЕ/хв).
Розрахунок
результатів
25-30ºC А = ΔЕ/хв х 4127
37ºC А = ΔЕ/хв х 8095
де: А – активність КФК в дослідному зразку,
Од/л.
ΔЕ – зміна оптичної щільності дослідного
зразка за хвилину одиниць оптичної щільності.
4127, 8095 – теоретичний чинник перерахунку для вираження активності КФК в Од/л.
Для
корекції результатів при інших температурах потрібно множити на:
|
Температура при вимірюваннях |
Чинник переходу |
||
|
25ºC |
30ºC |
37ºC |
|
|
25ºC |
1.00 |
1.56 |
2.44 |
|
30ºC |
0.64 |
1.00 |
1.56 |
|
37ºC |
0.41 |
0.63 |
1.00 |
Нормальні величини
|
|
25ºC |
30ºC |
37ºC |
|
Жінки до |
75 Од/л |
110 Од/л |
170 Од/л |
|
Чоловіки до |
80 Од/л |
130 Од/л |
195 Од/л |
Клініко-діагностичне значення
визначення активності КФК.
Креатинфосфокіназа
–
фермент. Який здійснює зворотну реакцію перетворення креатину на креатинфосфат
з використанням залишку АТФ і в такий спосіб забезпечує м’язи резервом енергії
у вигляді високоенергетичної фосфатної групикреатинфосфату. КФК належить до
класу трансфераз. Міститься цей фермент винятково у м’язах: серцевому м’язі,
селетних і гладких м’язах, а також у головному мозку.
Фізіологічне
підвищення активності
КФК у сироватці крові спостерігається у новонароджених та породіль (у перші дні
після пологів), при фізичному навантаженні.
Значне
підвищення
спостерігається при інфаркті міокарда, дистрофії м’язів, у стані шоку та при
недостатності кровообігу.
Помірне
підвищення
спостерігається при дрібновогнищевому інфаркті міокарда, обмеженому ушкодженні
скелетних м’язів. Судомах, гіпотиреозі, розладі мозкового кровообігу, травмах
мозку, гострих психічних станах.
Примітки:
1.Досліджувані
сироватки або плазми повинні бути ретельно відокремлені від формених елементів
крові не пізніше, ніж через 1 годину після взяття крові.
2.Уникайте
використання мутних, ліпідних та гемолітичних зразків.
3.Стабільність
зразків 7 днів при 2-8ºC, в захищеному
від світла місці. Активність креатинкінази знижується на 10% після 1 дня
зберігання при 2-8ºC або після 1 години при 15-25ºC.
Ознаки
погіршення реагентів
- Присутність часток або помутніння.
-
Початкова Е при 340нм ≥ 1.60
ІV. Контрольні питання до
закріплення знань з теми «Обмін простих білків та амінокислот».
1.Клітинна
організація ферментів. Мембранозалежні ферменти.
2.Властивості ферментів
як біокаталізаторів: специфічність дії,
термолабільність,
залежність ферментативної активності від рН середовища.
3.Інгібітори ферментів.
Типи гальмування ферментативних
реакцій. Застосування інгібіторів
ферментів як лікарських
препаратів в
медичній
практиці.
4.Принципи
визначення та одиниці ферментативної активності.
5.Хімічна
природа та структура ферментів.
6.Поняття
про коферменти, їх значення, класифікація коферментів.
7.Принцип
визначення активності КФК в сироватці крові та плазмі крові.
8. Поняття про
активний та алостеричний центри
ферментів. Алостеричний
ефект. Регуляторні ферменти.
9. Ізоферменти, визначення,
будова, приклади.
10. Мультиферменти, визначення,
будова, приклади, значення.
V. Висновок до практичного заняття.
VІ. Домашнє завдання
- Конспект лекції «Фенрменти»
- Біологічна хімія з біохімічними методами
дослідження / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило.
— К.: Медицина, 2009.(ст 149-175).
- Іваницька Г.І., Люленко Л.В.,
Іваницька М.В.
Практикум з клінічної біохімії: навч. посіб. — К.: Медицина, 2010. (ст.83-89)
Немає коментарів:
Нові коментарі наразі не дозволено.